Universitat d'Alacant

En la última década, el sistema CRISPR-Cas se ha convertido en la herramienta más versátil para la edición genética, permitiendo a los científicos “cortar” y “reemplazar” secuencias de ADN con una precisión sin precedentes. La presente invención describe una nueva variante de la proteína Cas12a, denominada AlCas12a (véase Figura 1) que promete superar dos de las limitaciones más habituales de sus predecesoras: su gran tamaño y la necesidad de un motivo PAM (Protospacer Adjacent Motif) muy restrictivo.

Figura 1: relaciones filogenéticas entre proteínas Cas12 mediante un árbol filogenético de AlCas12a, proteínas asignadas a la familia Cas12a, incluyendo ortólogos de Patescibacteria (sombreado), miembros del grupo Cas12a (sombreado) y ortólogos de la familia Cas12b1 (sombreado).

AlCas12a (véase Figura 2) proviene de un metagenoma de aguas residuales, un entorno rico en bacterias que a menudo poseen sistemas de defensa CRISPR poco estudiados. Esta proteína contiene 1226 aminoácidos, un 20% menor que la versión más común de Cas12a (alrededor de 1400 aminoácidos). Este tamaño reducido facilita su introducción en vectores de clonación y su expresión en células, tanto procariotas como eucariotas.

Figura 2: representación esquemática del cóntigo donde se localiza el locus CRISPR-alcas12a.

El motivo PAM que reconoce AlCas12a es TTN (dos timinas seguidas de cualquier nucleótido), uno de los más permisivos entre las Cas12a conocidas. En la práctica, esto significa que la enzima puede dirigirse a un número mucho mayor de secuencias diana dentro del genoma, ampliando el espectro de posibilidades.

La presente invención describe experimentos in vivo, concretamente en la bacteria Escherichia coli, que confirmaron la preferencia por TTN y la validación de su uso en edición genética, así como ensayos bioquímicos in vitro que permitirieron caracterizar las distintas actividades y requerimientos de la proteína AlCas12a.

Una característica sorprendente de AlCas12a es la ausencia de actividad ribonucleasa. La mayoría de las Cas12a procesan el ARN precursor (pre-crRNA) en ARN-guías maduros que luego se unen a la enzima. AlCas12a, sin embargo, no muestra esta capacidad, lo que abre la posibilidad de usar ARN-guía sintéticos con modificaciones que normalmente serían degradadas por la propia enzima.

En cuanto a su función de corte, AlCas12a actúa de tres maneras distintas:

1. Corte específico (en cis): la proteína reconoce la secuencia diana con su crRNA guía y corta ambas hebras de ADN, generando extremos sobresalientes de una sola hebra. Los ensayos in vitro con fragmentos de 840 pb demostraron un 94 % de corte en 15 min a 37 °C, y que la temperatura óptima se sitúa entre 35 °C y 40 °C (véase Figura 3), lo que la hace adecuada para la mayor parte de seres vivos.

2. Corte inespecífico dependiente de guía (en trans): una vez activada por la unión a su diana, AlCas12a puede degradar cualquier molécula de ADN de cadena sencilla (ADNcs) (véase Figura 3: imágenes A y D). Este comportamiento, similar al de otras Cas12a, se ha aprovechado para la detección de nucleótidos en diagnóstico molecular.

3. Corte inespecífico independiente de guía: requiere una cadena sencilla de ADN (véase Figura 3: imágenes B, C y D).

Figura 3: varios ejemplos de los resultados de electroforesis en gel de agarosa de muestras de ensayos in vitro de escisión de ADNbc por AlCas12a en diferentes condiciones de reacción.

En experimentos con bacterias que expresan AlCas12a se observó una reducción significativa de la susceptibilidad a virus de ADN de cadena sencilla (M13) y de doble hebra (P1), incluso cuando la enzima no estaba dirigida a una secuencia específica (véase Figura 4).

Figura 4: halos de inhibición del crecimiento de cultivos de E. coli incubados durante 16 horas a 37 ºC en placas tras depositar en su superficie gotas de diluciones decimales de una suspensión del fago de ADNcs M13mp18 (M13) o del fago de ADNbc P1-vir (P1).

Para demostrar su utilidad práctica en edición genética, los autores diseñaron un sistema de edición en E. coli que combina AlCas12a con un crRNA dirigido al gen pyrF. La presencia de la enzima y el crRNA provocó la eliminación de 607 pb en el genoma con una frecuencia de 90%, lo que confirma la potencia de la herramienta para seleccionar mutantes. Además, se desarrolló una variante “inactiva” (dAlCas12a) mediante mutaciones en los residuos catalíticos D831A, E921A y D1183A (véase Figura 3: imagen F). Estas versiones sin actividad de corte pueden fusionarse con dominios proteicos con distintas actividades.

En resumen, AlCas12a representa un avance significativo en la ingeniería genética, ofreciendo una enzima más pequeña y más flexible.

VENTAJAS DE LA TECNOLOGÍA

Esta novedosa tecnología aporta las siguientes ventajas:

1. El tamaño reducido de la proteína AlCas12a (1226 aminoácidos) facilita la administración mediante vectores plasmídicos y virales.

2. El reconocimiento de PAM flexible (nucleótidos 5’-TTN-3’) amplía el número de sitios editables.

3. La actividad de corte en trans posibilita la creación de sistemas de diagnóstico molecular.

4. El rango operativo de temperatura (entre 20-45 °C) permite su aplicación en una gran diversidad de organismos, incluyendo plantas y animales (tanto ectotermos, como endotermos).

5. Permite la defensa universal contra ADN invasor sin necesidad de crRNA, protegiendo a las bacterias de virus de ADN, independientemente de su secuencia.

6. Los mutantes “dead” AlCas12a sin actividad de corte se pueden utilizar como reguladores de expresión, entre otras muchas aplicaciones.

7. Potencial como antibacteriano específico de secuencia, ofreciendo una alternativa a los antibióticos.

8. Tienen el potencial de permitir el silenciamiento o la eliminación de genes, mutagénesis y correcciones de secuencias específicas del genoma de cualquier célula de una manera fácil, rápida y altamente precisa.

9. La incapacidad de AlCas12a para procesar los ARN-guía permite utilizar guías optimizadas con secuencias modificadas sin el riesgo de que éstas sean alteradas por la proteína efectora.

ASPECTOS INNOVADORES DE LA TECNOLOGÍA

AlCas12a es más pequeña que la mayoría de las variantes comerciales y es capaz de reconocer un patrón de ADN (PAM) muy sencillo (5’-TTN-3’), lo que amplía el rango de dianas editables y facilita su administración a células.

AlCas12a mantiene la actividad de corte en cis y en trans, además de una potente degradación de ADN de cadena sencilla sin guía, lo que la convierte en una herramienta versátil para edición genética, diagnóstico de enfermedades y producción de antibacterianos específicos. También carece de actividad ribonucleasa, permitiendo usar crRNAs modificados sin alterar su secuencia.

Se ha identificado y codificado una nueva endonucleasa (AlCas12a) de tamaño reducido que se expresa de forma estable en E. coli y que se purifica mediante una etiqueta de Histidina sin comprometer su actividad.

Los ensayos in vitro de digestión (corte en cis) han demostrado que la enzima reconoce un motivo PAM muy permisivo de solo dos nucleótidos (5′-TTN-3′), lo que amplía el rango de posibles dianas.

La ausencia de actividad ribonucleasa permite el uso de crRNAs con secuencias modificadas.

Se ha confirmado la actividad de corte en trans y la capacidad de degradar ADN de cadena sencilla de forma independiente de guía, lo que abre aplicaciones en diagnóstico y en defensa innata contra virus bacterianos.

Además, la enzima ha sido empleada con éxito para la edición del genoma de E.coli, facilitando la selección de células editadas.

Actualmente, la tecnología se encuentra en fase de validación experimental (TRL 4), respaldada por experimentos de laboratorio y pruebas celulares que demuestran su funcionalidad y potencial en edición genética, diagnóstico y desarrollo de antibacterianos. El diseño incorpora facilidades de transporte, manipulación y administración a células, lo que la posiciona como una plataforma lista para pruebas piloto en biotecnología, biomedicina y agricultura.

La patente describe usos que van desde la edición genética en plantas y animales, el desarrollo de bacterias resistentes a virus y la detección rápida de patógenos. La combinación de un tamaño compacto, un PAM permisivo y la ausencia de actividad ribonucleasa posiciona a AlCas12a como una herramienta versátil que puede adaptarse a las necesidades de investigación y biotecnología con mayor facilidad que las versiones actuales de Cas12a.

Entre los principales campos de aplicación, destacan los siguientes: Biología, Biotecnología, Biomedicina y Agroalimentación, siendo los siguientes usos los más importantes:

• Edición genética.

• Producción de antibactarianos.

• Degradación inespecífica de secuencias de ADN de cadena sencilla.

• Selección de mutantes.

• Diagnóstico molecular.

• Regulación de la expresión génica.

• Modificación epigenética.

Su potencial para la edición precisa, la detección de secuencias específicas y la protección contra infecciones bacterianas, especialmente cuando la bacteria presenta resistencia a antibióticos, abre nuevas vías para la investigación básica y la aplicación clínica, consolidando el papel de los sistemas CRISPR-Cas como pilares de la biología moderna.

Se buscan empresas interesadas en adquirir esta tecnología para su explotación comercial mediante acuerdos de licencia de la patente.

Perfil de empresa buscado:

• Empresas de edición genética.

• Laboratorios de diagnóstico molecular.

• Fabricantes de antibacterianos y agentes antimicrobianos.

• Empresas farmacéuticas y de biomedicina.

• Compañías de vectores de administración genética.

• Instituciones de investigación y universidades con programas de biología sintética y microbiología.

• Start-ups de biotecnología enfocadas en soluciones de control de infecciones y resistencia bacteriana.

La presente invención se encuentra protegida mediante solicitud de patente:

• Título de la patente: “Proteína endonucleasa Cas12a y sistema CRISPR-Cas12a asociado”.

• Número de solicitud: P202530287.

• Fecha de solicitud: 7 de abril de 2025.